(一)無(wú)菌操作前的準(zhǔn)備工作

培養(yǎng)材料接種時(shí)的無(wú)菌操作過(guò)程除上述各項(xiàng)消毒滅菌操作外，還需完成以下無(wú)菌操作步驟，從而獲得接種的無(wú)菌培養(yǎng)材料。

工作人員無(wú)菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對(duì)手臂消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)。如進(jìn)入層流操作室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)完成緩沖準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)的淋浴、一次更換滅菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護(hù)衣帽、手套、拖鞋等；再在風(fēng)淋區(qū)進(jìn)行無(wú)菌風(fēng)淋后方可進(jìn)入層流操作室。進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)后，再用70%～75%的酒精擦拭雙手和前臂，完成無(wú)菌操作準(zhǔn)備工作。

用70%～75%酒精擦洗工作臺(tái)面后，將已消毒滅菌的實(shí)驗(yàn)用品取出，并將操作器械放置在無(wú)菌器械支架上，然后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，對(duì)所有操作器械每次使用后都要進(jìn)行滅菌，常采用酒精燈火焰灼燒滅菌。

(二)無(wú)菌操作步驟

準(zhǔn)備工作完成后，對(duì)來(lái)自于自然生長(zhǎng)條件下的外植體，按上述培養(yǎng)材料消毒方法滅菌后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后置超凈工作臺(tái)酒精燈火焰下方，用滅菌剪刀等器械進(jìn)行適當(dāng)分離、切割或其它處理后備用。

在酒精燈火焰處將培養(yǎng)容器的瓶塞(蓋)輕輕打開(kāi)，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置入培養(yǎng)液上，將鑷子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精燈上灼燒后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數(shù)秒后塞回瓶口。對(duì)繼代培養(yǎng)材料的無(wú)菌操作，需在燈焰處打開(kāi)瓶塞(蓋)，繼代材料為液體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)直接用滅菌吸管吸取培養(yǎng)細(xì)胞液放入新培養(yǎng)液中；繼代材料為固體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用滅菌鑷子挑取適量材料置新培養(yǎng)液上；繼代材料為其他組織時(shí)，用滅菌剪刀或其他器械進(jìn)行培養(yǎng)材料適當(dāng)切割后，用滅菌鑷子將其置于新培養(yǎng)液上(中)，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數(shù)秒后塞回瓶口。

(三)污染源及其表現(xiàn)特征

當(dāng)培養(yǎng)材料、轉(zhuǎn)接器皿、無(wú)菌操作環(huán)境等消毒滅菌不徹底時(shí)，培養(yǎng)材料則攜帶有微生物(microorganism)，當(dāng)其被轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液上時(shí)，微生物繁殖迅速，出現(xiàn)各種污染菌斑。

微生物生長(zhǎng)時(shí)分泌出對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，致使培養(yǎng)材料死亡或失去使用價(jià)值。在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)材料附近出現(xiàn)黏液或混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡沫，這是細(xì)菌性污染。在細(xì)菌性污染中，特別要注意一種呈乳白色的芽孢桿菌污染，它可出現(xiàn)在培養(yǎng)液表面，或呈滴形云霧狀存在于培養(yǎng)液內(nèi)，若出現(xiàn)應(yīng)嚴(yán)格滅菌。而培養(yǎng)液表面出現(xiàn)的黃色、白色、黑色等不同顏色的霉菌，這是真菌性污染。