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無菌操作原則介紹

1、環(huán)境要清潔,進(jìn)行無菌操作前半小時(shí),須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動(dòng),防止塵埃飛揚(yáng)。治療室應(yīng)每天用紫外線消毒一次。 
  2、進(jìn)行無菌操作時(shí),衣帽穿戴要整潔。帽子要把全部頭發(fā)遮蓋,口罩須遮住口鼻,并修剪指甲、洗手。 
  3、無菌物品與非無菌物品應(yīng)分別放置。無菌物品不可暴露在空氣中,必須放于無菌包或無菌容器內(nèi),無菌物品一經(jīng)使用后,必須再經(jīng)滅菌處理后方可使用。從無菌容器中取出的無菌物品,雖未使用,也不可放回?zé)o菌容器內(nèi)。 
  4、無菌包應(yīng)注明物品的名稱、消毒滅菌日期,并按日期先后順序排放,以便取用,放在固定的地方。無菌包在未污染的情況下,可保存7-14天,過期應(yīng)重新滅菌。   5、取無菌物品時(shí),必須用無菌持物鉗(鑷)。未經(jīng)消毒的用物不可觸及無菌物或跨越無菌區(qū)。 
  6、進(jìn)行無菌操作時(shí),如器械、用物疑有污染或已被污染,即不可使用,應(yīng)更換或重新滅菌。 
  7、一份無菌物品,只能供一個(gè)病員使用,以免發(fā)生交叉感染。 無菌操作注意事項(xiàng): 
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70 %  ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后,才開始實(shí)驗(yàn)操作。每  次操作只處理一株細(xì)胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細(xì)胞間  污染。實(shí)驗(yàn)完畢后,將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái),以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間  隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后,再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。  
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可  
以暫時(shí)放置,其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出,以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦  拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操  作。  
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打  
開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45° 角取用,  盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。  
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全,須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病
毒  
感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作,并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(**少Class II)。操作過程  中,應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。  5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目:  5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力  
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。  5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預(yù)濾網(wǎng)(300  小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時(shí)/HEPA)。  
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水 植物外植體消毒和接種: 
用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器官和細(xì)胞稱為外植體。在組織培養(yǎng)中,外植體如果是帶菌的,在接種前都必須進(jìn)行表面消毒,這是取得培養(yǎng)成功的**基本的和重要的前提。常用消毒劑對(duì)外植體進(jìn)行消毒。從室外取的材料,一般先用自來水沖洗數(shù)分鐘,對(duì)表面不光滑或長(zhǎng)有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料,自來水沖洗的時(shí)間要長(zhǎng),幾個(gè)小時(shí)或過夜,并且用洗衣粉或洗潔精洗滌,必要時(shí)用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干,然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后,要用無菌水洗滌3~5 遍,**后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達(dá)到消毒目的,又不能損傷植物組織和細(xì)胞,還要符合就地取材的原則。對(duì)一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行表面消毒時(shí),用單一消毒劑不能收到好的效果,所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般,shou先用75%乙醇浸泡外植體數(shù)秒鐘**30s,然后置于0.1%氯化汞溶液5~10min 或含有2%活性氧的次氯酸鈉溶液5~30min,然后用無菌水洗滌。有時(shí)在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后,用無菌水洗,進(jìn)一步剝?nèi)讓咏M織或器官如葉片后,再用次氯酸鈉滅菌3~5min,無菌水漂洗3 次后,切割、用于接種。 
用消毒劑對(duì)接種材料進(jìn)行滅菌處理時(shí),可以在滅菌溶液中加入1~2 滴表面活性劑,如吐溫80或吐溫20,它們可以濕潤(rùn)外植體整個(gè)組織,促進(jìn)滅菌液充分接觸表面組織,達(dá)到較好的消毒效果。有時(shí)還可以用磁力攪拌、超聲振動(dòng)等方法使消毒殺菌劑進(jìn)入外植體。消毒溶液對(duì)外植體消毒是在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養(yǎng)基中。   
植物外植體消毒和接種(以胡蘿卜為例): 
1 .接種前,用75 %乙醇棉球或用2%苯扎溴銨溶液擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面,將培養(yǎng)基及用具放入工作臺(tái),開超凈工作臺(tái)紫外燈照射**少20 min,然后開送風(fēng)開關(guān),之后關(guān)閉紫外燈,通風(fēng)10 min后,再開日光燈進(jìn)行無菌操作。 
2 .將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈,用小刀切去外圍組織,切成小塊分別放100 mL 燒杯中,用75%乙醇溶液浸泡30s,然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ,用無菌水洗滌3 次,無菌紙吸干水分。取出培養(yǎng)皿,剪刀和鑷子使用前插入90%乙醇溶液中,使用鑷子時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻,冷卻后,切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#3 .將培養(yǎng)容器斜面向上,并使它們拉于水平位置,也可將培養(yǎng)容器放在左手中。將塞蓋用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動(dòng),以便接種時(shí)拔出。用火焰灼燒管口,灼燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口(靠手腕的動(dòng)作,使試管口沾染的少量菌得以燒死)。將燒過的接種針(環(huán))觸動(dòng)培養(yǎng)基部分,使其冷卻,以免燒死被接種的外植體,然后輕輕接觸外植體,慢慢將接種針(環(huán))抽出試管,打開培養(yǎng)容器蓋,將外植體放在培養(yǎng)基上,每瓶放3 塊。封口,貼標(biāo)簽,注明姓名,標(biāo)明時(shí)間和材料名稱。整理好接種室(箱)的臺(tái)面,搞好清潔衛(wèi)生。 
4 .用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片,用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中,在超凈工作臺(tái)上加入75%乙醇溶液浸泡30s,然后用0.1%氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min,用無菌水洗滌3 次,將葉片切成長(zhǎng)1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。 
5 .綠豆種子用75%乙醇溶液浸泡30 s,然后用0.1%氯化汞溶液(加入吐溫2 滴)浸泡3 、5 、10 min ,期間不斷攪拌溶液,用無菌水洗滌5~6 遍,洗干種子外圍水分,按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。  
無菌操作原則: 
  一、在執(zhí)行無菌操作時(shí),必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。 
  二、執(zhí)行無菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并將手擦干,注意空氣和環(huán)境清潔。   三、夾取無菌物品,必須使用無菌持物鉗。    [無菌操作間]  
無菌操作間 
四、進(jìn)行無菌操作時(shí),凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。   五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi),不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌,應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。 
  六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi),并保持清潔干燥,與非滅菌包分開放置,并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期,其中用物是否適量。 
  七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次,容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布?jí)K等,不可裝得過滿,以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。  
原則及注意事項(xiàng) 
無菌操作原則: 
  一、在執(zhí)行無菌操作時(shí),必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。   二、執(zhí)行無菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并將手擦干,注意空氣和環(huán)境清潔。   三、夾取無菌物品必須使用無菌持物鉗。  
  
 
無菌操作間 
四、進(jìn)行無菌操作時(shí),凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。   五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi),不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌,應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。   六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi),并保持清潔干燥,與非滅菌包分開放置,并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期,其中用物是否適量。   七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次,容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布?jí)K等,不可裝得過滿,以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。  
無菌操作技術(shù)及注意事項(xiàng) 
1、玻璃器皿的消毒和清潔   ⑴新購(gòu)玻璃器皿的處理新購(gòu)玻璃器皿應(yīng)用熱肥皂水洗刷,流水沖洗,再用1%~2%鹽酸溶液浸泡,以除去游離堿,再用水沖洗。對(duì)容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等,經(jīng)清水洗凈后應(yīng)注入濃鹽酸少許,慢慢轉(zhuǎn)動(dòng),使鹽酸布滿容器內(nèi)壁數(shù)分鐘后傾出鹽酸,再用水沖洗。   ⑵污染玻璃器皿的處理   ①一般試管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡,再煮沸30分鐘,或在3%~5%漂白粉澄清液內(nèi)4小時(shí),有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產(chǎn)生泡沫,然后用清水沖洗**無肥皂為止。**后用少量蒸餾水沖洗。   ②細(xì)菌培養(yǎng)用的試管和培養(yǎng)皿可先行集中,用1kg/cm2高壓滅菌15~30分鐘,再用熱水洗滌后,用肥皂洗刷,流水沖洗。   ③吸管使用后應(yīng)集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時(shí),逐支用流水反復(fù)沖洗,再用蒸餾水沖洗。   ④油蠟沾污的器皿,應(yīng)單獨(dú)滅菌洗滌,先將沾有油污的物質(zhì)棄去,倒置于吸水紙上,100℃烘干半小時(shí),再用堿水煮沸,肥皂洗滌,流水沖洗。必要時(shí)可用二甲苯或汽油去油污。   ⑤染料沾污的器皿,可先用水沖洗,后用清潔或稀鹽酸洗脫染料,再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性,所以不宜用肥皂的堿水洗滌。   ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡,取出后流水沖洗,再用肥皂或弱堿性煮沸,自然冷卻后,流水沖洗。被結(jié)核桿菌污染或不易洗凈的玻片,可置于清潔液內(nèi)浸泡后再?zèng)_洗。   2、無菌器材和液體的準(zhǔn)備將玻璃器具中的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后,用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花,裝入干凈的鋁盒或鐵盒中,于120℃的干燥箱中干燥滅菌2小時(shí),取出備用。對(duì)于手術(shù)器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液,則采用高壓蒸氣滅菌法,即在15磅的條件下,加熱20分鐘。而對(duì)于MEM培養(yǎng)液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負(fù)壓抽濾后使用。   3、無菌操作過程在無菌操作過程中,**重要的是要保持工作區(qū)的無菌、清潔。因此,在操作前20~30分鐘要先啟動(dòng)超凈臺(tái)和紫外燈,并認(rèn)真洗手和消毒。在操作時(shí),嚴(yán)禁喧嘩,嚴(yán)禁用手直接拿無菌物品,如瓶塞等,而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養(yǎng)瓶應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作,并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。對(duì)于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處,戴上膠皮乳頭,并用酒精燈燒烤之后再吸液體。   4、常用清潔液的配制法⑴重鉻酸鉀清潔液:可根據(jù)不同需要,選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中,再慢慢加入濃硫酸。注意,此#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#時(shí)可產(chǎn)生高熱,應(yīng)防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強(qiáng),腐蝕性大,應(yīng)避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質(zhì),此液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差,可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸,還可繼續(xù)使用。直到液體變藍(lán)綠色,即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時(shí),宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿時(shí),應(yīng)特別注意防止產(chǎn)生高熱而破裂,切忌用量筒來配制。   ⑵磷酸三鈉將其配成5%~10%水溶液,可用于洗滌玻璃器皿上的油污,但經(jīng)常使用腐蝕玻璃,使器皿表面模糊、毛糙。   ⑶硝酸清潔液將其配成50%水溶液,可用于清潔微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二鈉(EDTA鈉鹽)將其配成5%~10%水溶液,可洗脫粘附于玻璃器皿內(nèi)壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白質(zhì)的良好溶劑,適用于洗滌粘附有血液血清等蛋白質(zhì)的吸管、試管等。  
  
無菌操作法 
2007-10-24 17:23   【大 中 小】【我要糾錯(cuò)】   無菌操作法,是整個(gè)過程控制在無菌條件下進(jìn)行的一種操作方法。某些藥品加熱滅菌后發(fā)生變質(zhì)、變色或降低含量者可采用無菌操作法制備。此種無菌操作,不僅用于注射劑而且對(duì)其它的如滴眼劑、海棉劑等用于粘膜和創(chuàng)傷的制劑也均適用。無菌操作室或無菌操作所用的一切用具、材料以及環(huán)境,均須應(yīng)用面所述滅菌法滅菌,操作須在無菌操作室或無操作柜內(nèi)進(jìn)行。 
  (一)無菌操作的空氣滅菌可應(yīng)用上節(jié)《氣體滅菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具體用法不再贅述。藥廠大型無菌操作,常用甲醛溶液加熱熏蒸進(jìn)行空氣滅菌。將甲醛溶液放入瓶?jī)?nèi),逐漸被吸收蒸氣夾層加熱鍋中,甲醛溶液被加熱,甲醛蒸氣經(jīng)氣出口送入總進(jìn)風(fēng)道,由鼓風(fēng)機(jī)吹入無菌操作室,連續(xù)3小時(shí)后,一般即可將鼓風(fēng)機(jī)關(guān)閉。室溫應(yīng)保持25℃以上,以免室溫過低甲醛蒸氯了聚合而附著于冷表面,濕度應(yīng)保持60%以上,密閉熏蒸12-24小時(shí)以后,再將25%氨水加熱(每m3用8-10ml),從總風(fēng)道送入氨氣約15分鐘,以吸收甲醛蒸氣,然后開啟總出口排風(fēng),并通入經(jīng)處理過的無菌空氣直到室內(nèi)無臭氣為止。   除用上述方法定期進(jìn)行較徹底的滅菌外,還要對(duì)室內(nèi)的空間、用具(桌椅等)、地面、墻壁等,用3%酚溶液、2%煤酚皂溶液、0.2%新潔而或75%酒精噴灑或擦試。其它用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前開啟外線一小時(shí),中午休息時(shí)間也要開1/2-1小時(shí)。 
  (二)無菌操作操作人員進(jìn)入操作之前要洗澡并換上已經(jīng)滅菌的工作服和清潔的鞋子,不使頭發(fā)、內(nèi)衣等露出來,以免造成污染機(jī)會(huì)。安瓿要150-180℃2-3小時(shí)干熱滅菌。橡皮塞要以121℃1小時(shí)熱壓滅菌。有關(guān)器具、機(jī)器都要經(jīng)過滅菌。用無菌操作法制備的注射劑, 大多要加入抑制。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理   小量無菌制劑的制備,也可在無菌操作柜中進(jìn)行。無菌操作柜分小型無菌操作與聯(lián)合無菌無操作兩種小型無菌操作柜又稱單人無菌柜。式樣有單面式與雙面式兩種。操作柜的架子用木制,四周配以玻璃,前面操作下裝木板,挖二圓孔,孔內(nèi)密接橡皮手套或袖套。藥品及用具等,由側(cè)門送入柜內(nèi)后關(guān)閉。操作時(shí)可完全與外界空氣隔jue。柜內(nèi)空氣的滅菌,可在柜中央上方裝一小型紫外線燈,使用前1小時(shí)啟燈滅菌,或用藥液(如3%酚溶液)噴霧滅菌。聯(lián)合無菌操作柜是由幾個(gè)小型操作柜聯(lián)合制成,以使原料的精制,傳遞分裝及成品暫時(shí)存放等工作全部在柜內(nèi)進(jìn)行。近年來,采用層流潔凈工作臺(tái)作無菌操作,使用方便,效果可靠。意義 
無菌是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。在微生物實(shí)驗(yàn)中, 操作的目的在于防止待接種細(xì)菌被雜菌污染。只有在培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器皿等處于無菌的前提下,才能保證菌種不被污染。  接種細(xì)菌時(shí),應(yīng)注意以下幾項(xiàng):  
(1)在超凈工作臺(tái)上操作,工作臺(tái)在使用前要紫外消毒,酒精消毒等  (2)應(yīng)在酒精燈火焰前操作  
(3) 取菌種前灼燒接種針或接種環(huán)(要燒紅)  
(4)燒紅的接種針(環(huán))稍事冷卻再取菌種,以免燒死菌種  (5)接種后應(yīng)盡快塞上棉塞  
總之,一句話,盡可能防止雜菌污染?。。?!